Thermo Scientific™ EZ-Link™ Desthiobiotinylering og Pull-Down Kit

De Thermo Scientific EZ-Link Desthiobiotinylation and Pull-Down Kit er et komplet sæt reagenser til at biotinmærke oprensede proteiner og bruge dem til at oprense interaktionskomplekser ved hjælp af streptavidin agaroseharpiks med milde elueringsbetingelser.

Dette alt-i-én mærknings- og oprensningskit bruger Sulfo-NHS-LC-Desthiobiotin, et aminreaktivt NHS-esterreagens, til effektivt at mærke en oprenset eller blandet proteinprøve til brug som lokkemad til at fange og oprense proteininteraktioner. Desthiobiotin-mærkerne af mærkede proteiner binder til streptavidin med høj specificitet, men eluerer dog let under meget milde betingelser (dvs. ved konkurrerende fortrængning med regulært, frit biotin). Systemet muliggør effektiv, men skånsom indfangning og isolering (pull-down) af specifikke proteininteraktionskomplekser fra cellelysater ved hjælp af streptavidinagaroseperler. Det komplette kit inkluderer brugsklare 1 mg hætteglas med desthiobiotinyleringsreagens, afsaltningskolonner til at behandle mærket protein og højkapacitets streptavidinagarose med buffere til at udføre adskillige mikrocentrifugeskala pull-down assayeksperimenter med lethed. Identificer nye interaktioner mellem et kendt protein (lokkemad) og tidligere uopdaget mål (bytte), eller bekræft interaktioner mellem kendte agn- og bytteproteiner.

Højdepunkter:

• Sulfo-NHS-LC-Desthiobiotin - mærke proteiner med en biotin-lignende, der specifikt binder streptavidin, men som også let elueres under milde tilstande
• Pull-down assay - enkel, optimeret protokol og reagenser til at mærke proteiner og genvinde (oprense) intakte, funktionelle proteininteraktionskomplekser
• Komplet sæt - inkluderer mærkningsreagens og afsaltningskolonner til fremstilling af lokkemadproteiner og streptavidin agarose og elueringsbuffer til at udføre pull-down

Produktdetaljer:
Desthiobiotin er en enkeltringet, svovlfri analog af biotin, der binder til streptavidin med næsten samme specificitet, men mindre affinitet end biotin (henholdsvis 1/Kd = 10^11 vs. 10^15M)[1-2]. Følgelig kan desthiobiotinylerede lokkemadproteiner og deres interagerende partnere elueres let og specifikt fra streptavidin-affinitetsharpiks under anvendelse af milde betingelser baseret på konkurrerende fortrængning med frit biotin. Til pull-down assay-eksperimenter med biologiske prøver hjælper denne bløde frigivelseskarakteristik af desthiobiotin også til at minimere samtidig oprensning af endogene biotinylerede molekyler, som forbliver bundet til streptavidin efter eluering af målproteinkomplekserne med frit biotin. Det modificerede avidin-biotin-affinitetssystem eliminerer også behovet for at bruge barske elueringsbetingelser, der kan adskille komplekser og/eller beskadige målproteinet eller cellen. Desthiobiotin-baserede teknikker er ideelle, når der anvendes native eller rekombinante proteiner, der ikke udtrykkes med et fusionsmærke, og ved isolering af indfangede proteiner under native forhold, såsom målretning af intakte celler eller celleoverfladeproteiner.
Sulfo-NHS-LC-Desthiobiotin er en variant af biotin, der aktiveres som en sulfo-NHS-ester med en langkædet (LC) spacerarm til kovalent at mærke primære aminer (-NH2) af proteiner eller andre molekyler med desthiobiotingrupper. De No-Weigh Format (1mg genlukkelige hætteglas) eliminerer vanskelighederne forbundet med vejning af små mængder reagens og maksimerer beskyttelsen af ubrugt reagens mod hydrolyse.