Melford Proteinase K

Fra Tritirachium album. Serinprotease til proteolytisk inaktivering af nukleaser under isolering af DNA og RNA.

Oversigt

Proteinase K er en meget reaktiv serinprotease, der udviser en evne til at fordøje native proteiner og derved inaktivere enzymer såsom DNase og RNase uden at gribe til en denatureringsproces. Det er den mest kraftfulde proteinase blandt alle proteinaser, der hidtil er karakteriseret. Det spalter ved peptidbindingen, der støder op til carboxylsyregruppen af alifatiske, aromatiske eller hydrofobe aminosyrer.

Rekombinant Proteinase K anvendes til isolering eller fremstilling af nukleinsyrer med høj molekylvægt. Det er meget rent, har en højere specifik aktivitet og er mere stabilt ved stuetemperatur sammenlignet med naturligt proteinase K.

Rekombinant Proteinase K udtrykkes fra gær Pichia pastoris med et klonet gen, der koder for Engyodontium album (Tritirachium album) endolytisk protease.

Applikationer

• Rekombinant Proteinase K er ekstremt effektiv på native proteiner og kan derfor bruges til hurtigt at inaktivere endogene nukleaser såsom RNaser og DNaser. Denne egenskab gør Proteinase K særligt velegnet til isolering af nativt RNA og DNA fra væv eller cellelinjer.
• Anvendes til analyse af membranstrukturer ved at modificere proteiner og glykoproteiner på celleoverflader.
• Særligt velegnet til isolering af nukleinsyrer til amplifikationsreaktioner.
• Fremmer cellelyse ved at aktivere en bakteriel autolytisk faktor.
• Anvendes til at fjerne celleaffald under forberedelsen af koloniløft og til at behandle vævssnit for at sikre effektiv probeinfiltration under in situ hybridisering.

Rekonstitutionsanbefalinger:

Til fremstilling af stamopløsning foreslår vi at rekonstituere det frysetørrede pulver i en buffer (20 mM Tris, 1 mM CaCl ₂ , 2% Glycerol, pH 7,4).

Calcium er vigtigt for termostabiliteten af Proteinase K, og pH-værdien er kritisk for høj opløselighed.

Anvendelsen af kryobeskyttende glycerol til en slutkoncentration på 50 % i stamopløsning er for at forhindre fryse-/optøningsskader. Proteinase K bibeholdt 99 % af aktiviteten efter 12 fryse/tø-cyklusser i stamopløsning. Undgå gentagen frysning og optøning for at forhindre udfældning af proteinet, hvis glycerol ikke tilsættes.

Proteinase K-opløsning forbliver aktiv over et bredt pH-område (4,0-12,5, ofte brugt i området 7,5-9,0) og over et bredt temperaturområde på 25 C °til 75 °C. Opløsningen forbliver steril og stabil i mindst 12 måneder ved 4 °C.

Forsigtig: Proteinase K rekombinant lyofiliseret pulver er ikke sterilt. Stamopløsning kan fremstilles som en 20-40 mg/ml i 20 mM Tris-HCl-buffer, steriliseret med en 0,22μ m filter. Stamopløsning kan opbevares i 50 % glycerol i alikvoter ved et bredt temperaturområde fra 24 C °til -80 °C.

Til sterilfiltrering anbefaler vi at bruge PES pr PVDF membraner med lav proteinbinding.

Sammensætning (INGEN TILSÆTNINGSSTOFFER):

• ≥90% Protein Proteinase K, biuret test.
• Hjælpestoffer: Saccharose 8%
• DNA og RNA fri
• Endotoksin fri

Specifikationer:

• Stabil og aktiv over et bredt pH-område på 4 til 12, maksimal aktivitet er i pH-område på 7,5 til 12,0
• Aktiv med SDS, urinstof og EDTA. Den mest aktive temperatur er 65 °C.
• Inaktiveret af diisopropylfluorphosphater (DFP) og phenylmethansulfonylfluorid (PMSF).
• Oprensning: Nikkelaffinitetskromatografi efterfulgt af ionbytterkromatografi og dialyse.
• EC: 3.4.21.64