Invitrogen™ Premo Autofagi-analyser med sensor LC3B, p62 eller tandemsensor RFP-GFP-LC3B

Premo Autofagi-sensorer drager fordel af autofagi-associerede proteiner LC3B eller p62 sammen med GFP eller RFP til at detektere enten induktion eller inhibering af autofagi i celler. De Premo Autophagy-sensorer transduceres ved hjælp af BacMam (insekt- Bac ulovirus med en mamma -promotor) teknologi, hvilket muliggør entydig visualisering af de kimære proteiner i autophagosomer. BacMam-reagenser er ikke-replikerende i pattedyrsceller og derfor sikre at håndtere. De er også ikke-cytotoksiske og klar til brug. I modsætning til typiske ekspressionsvektorer muliggør BacMam-reagenser titrerbar og reproducerbar ekspression og tilbyder høj co-transduktionseffektivitet; derfor kan flere BacMam-reagenser let bruges på de samme celler. Nylige forbedringer af BacMam-systemet muliggør effektiv transduktion i en bredere række af celler, herunder neuroner og neurale stamceller (NSC'er) med en nem et-trinsprotokol. For at visualisere autofagi skal du blot tilføje BacMam Autophagy Sensor til celler og inkubere natten over for proteinekspression, og derefter registrere signal ved hjælp af standard GFP- og/eller RFP-fluorescensindstillinger på dit instrument.

LC3B-proteinet spiller en kritisk rolle i autofagi. Normalt findes dette protein i cytosolen, men efter spaltning og lipidering med phosphatidylethanolamin associerer LC3B med fagophoren. Denne lokalisering kan bruges som en generel markør for autofagiske membraner. p62-proteinet, også kendt som sequestosome (SQSTM1), er et ubitiquitin-bindende protein, der fungerer som en receptor for laster, der er bestemt til at blive nedbrudt af det cellulære autofagiske maskineri. Når autofagi induceres, lokaliseres p62-proteinet til autophagosomerne og nedbrydes efterfølgende. Omvendt akkumuleres p62-proteinet i autophagosomet med inhiberingen af autofagi. Således tjener den subcellulære lokalisering af en p62-fluorescerende proteinkimær som en nyttig markør for induktion og inhibering af autofagi.

Ved at kombinere den syrefølsomme GFP (dvs. Emerald GFP) med en syre-ufølsom RFP (dvs. TagRFP) i tandemsensoren RFP-GFP-LC3B kan ændringen fra et autophagosom (neutral pH) til autolysosomet (med en sur pH) visualiseres ved at afbilde det specifikke tab af den autophagosomale GFP efter fluorescens efter lyseksansen. fusion. Ved induktion af autofagi vil Premo Tandem Autophagy Sensor mærker de punkterede autophagosomer; disse strukturer er positive for både GFP og RFP. Når lysosomet er smeltet sammen, falder pH, hvilket slukker GFP, hvilket får autolysosomer til at se røde ud. Derudover kombinerer man Premo Autophagy Tandem Sensor med den langt røde emittering LysoTracker Deep Red (tilgængelig separat) giver mulighed for en tre-farvet analyse af autophagosomal/autolysomal/lysosomal dynamik.

hver Premo Autophagy assay kit inkluderer chloroquin diphosphat, som bruges som en negativ kontrol til at hæmme autophagy.

Fordele ved at bruge Premo Autofagi assays
•Multiplex inspireret— ved at kombinere Premo Autophagy Tandem Sensor med den langt røde emittering LysoTracker Deep Red giver mulighed for en trefarvet analyse af komplet autofagisk pathway-dynamik
•Meget effektivt leveringssystem— >90 % transduktion af en lang række pattedyrcellelinjer, herunder primære celler, stamceller og neuroner
•Hurtigt og bekvemt— blot tilføje Premo Autophagy-reagens til dine celler, inkuber natten over, og —afbild eller opbevar frosne, assay-klare celler til senere brug
•Robust— Premo Autophagy-reagenser er ikke-replikerende i pattedyrsceller, mangler observerbar cytopatisk effekt og er velegnede til biosikkerhedsniveau (BSL) 1-protokoller
• Flere konfigurationer: — Premo Autophagy-sensorer er tilgængelige i følgende kimære konfigurationer:
P36235: LC3B-GFP; kontrol LC3B (G120A)-GFP; P36236: LC3B-RFP; kontrol LC3B (G120A)-RFP; P36239: RFP-GFP-LC3B; P36240: GFP-p62; P36241: RFP-p62