Thermo Scientific™ Pierce™ Kolorimetrisk proteaseanalysesæt

Disse kolorimetriske og fluorescerende protease-assaysæt omfatter to forskellige metoder til måling af total proteaseaktivitet i biologiske prøver. Begge kits kan bruges til at vurdere fremskridtene af proteaseoprensningsprocedurer eller til at kvantificere proteasekontamination i proteinprøver. Sættene bruger succinyleret eller fluorescein-mærket kasein som et proteasesubstrat. Proteolyse af substratet resulterer i peptider, hvis aminogrupper eller ændrede fluorescensegenskaber muliggør påvisning i de respektive kits. Proteaseaktivitet kvantificeres ved sammenligning med trypsinstandard inkluderet i hvert kit.

Højdepunkter:

• Kasein substrat– måle aktiviteten af enhver protease, der spalter kasein til peptidfragmenter

• Trypsin standard– kvantificere proteaseaktivitet i forhold til trypsin, en universelt accepteret reference

• Følsom– 1000 gange mere følsom end assays, der bruger umodificerede former for kasein

• Enkelt og hurtigt– reagensglas- og mikropladeprotokoller afsluttes på mindre end en time

• Homogen– kun tilføjelsestrin; ingen adskillelse, overførsel eller stop trin påkrævet

• Kan tilpasses– nemt tilpasse tid, temperatur og pH for at optimere følsomheden for proteaser af interesse

Det kolorimetriske protease-assay-kit (delnr. 23263) bruger fuldt succinyleret kasein som et substrat for analysen. Hydrolyse af dette substrat i nærvær af protease resulterer i frigivelsen af peptidfragmenter med frie aminoterminale grupper. Disse peptider reageres med trinitrobenzensulfonsyre (TNBSA), efterfulgt af måling af absorbansforøgelsen, som er resultatet af dannelsen af gulfarvede TNB-peptidaddukter.

• Substrat: succinyleret kasein (ikke tilgængelig separat)
• Basis for assay: påvisning af primære aminer som følge af proteolyse
• Detektionsreagens: trinitrobenzensulfonsyre (TNBSA)
• Måling: absorbans ved 450 nm (pladelæser eller spektrofotometer)

Fluorescensproteaseanalysesættet (delnr. 23266) inkluderer fluorescein-mærket kasein som et substrat til vurdering af proteaseaktivitet i en prøve ved enten fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) med et standardfluorometer eller fluorescenspolarisering (FP) med egnet instrumentering. FTC-kasein er nativt kasein, der er blevet mærket ved hjælp af et stort molært overskud af fluorescein-isothiocyanat (FITC). Fluorescensegenskaberne af dette stærkt mærkede, intakte proteinsubstrat ændrer sig dramatisk ved fordøjelse med proteaser, hvilket resulterer i en målbar indikation af proteolyse.

• Substrat: fluorescein-mærket kasein (FITC-kasein); tilgængelig separat som del nr. 23267
• Basis for assay: ændring i fluorescensresonans (FRET) eller fluorescenspolarisering (FP)
• Måling: instrument med fluorescein excitation og emissionsfiltre (485/538nm)

Inkluderer:

Modificeret kasein, trypsin standard og Tris-bufret saltvand (begge sæt); TNBSA-løsning (kun delnr. 23263)

Anbefalet til:

Vurder funktionel integritet og overordnet fremskridt for proteaseoprensning; Kvantificer proteasekontamination i proteinprøver; Karakteriser aktiviteten af usædvanlige proteaser sammenlignet med trypsin; Evaluer bufferbetingelser for deres indvirkning på proteasefunktion og aktivitet