Thermo Scientific™ Dulbecco's Modified Eagle's Limiting Medium (DMEM-LM)

Thermo Scientific L-Photo-Leucin og L-Photo-Methionin er analoger af L-Leucin og L-Methionin-aminosyrer, der har aktiverbare diazirin-sidekæder, der er i stand til kemisk tværbinding til tilstødende molekyler, når de udsættes for ultraviolet lys. Ligesom deres naturligt forekommende modstykker kan disse fotoreaktive aminosyrer inkorporeres endogent i den primære sekvens af proteiner under syntese. Protein-protein-interaktionsdomæner, der involverer de syntetiserede proteiner i deres native miljøer, kan derefter tværbindes kovalent ved at aktivere diaziringrupperne. Traditionelle tværbindingseksperimenter kræver tilsætning af bifunktionelle kemiske tværbindingsmidler og tilhørende reagensopløsningsmidler, hvilket kan påvirke den cellebiologi, der undersøges, negativt. Brug af fotoreaktive aminosyrer minimerer disse potentielt negative virkninger og gør det muligt at studere og karakterisere både stabile og forbigående proteininteraktioner i celler med en høj grad af tillid. Når det bruges i kombination med specielt formulerede begrænsende cellemedier, der er blottet for leucin og methionin, behandles de fotoaktiverbare derivater, der forekommer naturligt af proteinsyrer, som syntesen af proteinet. Som et resultat kan de erstatte leucin eller methionin i den primære sekvens af proteiner. Når de udsættes for UV-lys, bliver diazirinringene reaktive mellemprodukter, der danner kovalente bindinger med nærliggende proteinsidekæder og rygrad. Naturligt associerede bindingspartnere bliver derefter øjeblikkeligt fanget. Tværbundne proteinkomplekser påvises ved nedsat mobilitet på SDS-PAGE efterfulgt af Western blot-detektion, størrelsesudelukkelseskromatografi, saccharosedensitetsgradientsedimentering eller massespektrometri.

Højdepunkter:

• In vivo mærkning– inkorporerer fotoreaktive grupper i proteiner ved hjælp af normalt cellulært maskineri

• In vivo tværbinding– finde interagerende proteiner i det native cellulære miljø

• Øget specificitet sammenlignet med traditionelle metoder– tværbindende interagerende proteiner korrekt placeret ved deres grænseflader inden for proteininteraktionsdomæner

• Supplerende til traditionelle metoder– giver detaljeret karakterisering af proteininteraktioner sammenlignet med resultater med formaldehyd og andre mere generelle tværbindingsmetoder

• Effektiv genopretning– 90% proteingenvinding i cellelysater efter tværbinding

• Kompatibel– tværbindingsproteiner udtrykt i en lang række cellelinjer, herunder HeLa, 293T, COS7, U2OS, A549, A431, HepG2, NIH 3T3 og C6

• Nem at bruge– reagenser er fotostabile under normal laboratoriebelysning, hvilket eliminerer behovet for at arbejde i mørke