Thermo Scientific™ Pierce™ Celleoverfladebiotinylerings- og isoleringssæt

Funktionerne i Cell Surface Protein Biotinylation and Isolation Kit inkluderer:
• Forbedret ydeevne —kit og protokol er blevet re-designet for at forbedre berigelse og ekstraktion af biotinylerede plasmamembranproteiner og samtidig minimere intracellulær proteinkontamination
•Optimeret —protokol er blevet opdateret for at reducere behandlingstiden og antallet af trin, og reagensformuleringer er optimeret til forbedret ydeevne
•Kompatible —reagenser er blevet verificeret med suspension og adhærente cellelinjer, med yderligere instruktioner til MS-prøveforberedelse
•Validerede applikationsreagenser —og procedurer er kompatible med western blotting og

MS applikationer. Dette brugervenlige kit indeholder alle de nødvendige komponenter og procedurer til optimal mærkning og efterfølgende isolering af celleoverfladeproteiner. Buffere leveres præ-formulerede for at give ensartede resultater. Pattedyrsceller mærkes først med EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin, et thiol-spaltbart aminreaktivt biotinyleringsreagens. Celler lyseres efterfølgende, og de mærkede proteiner fanges med NeutrAvidin Agarose. Dithiothreitol (DTT) bruges i elueringen for at reducere disulfidbindingerne i biotinmærket, hvilket resulterer i frigivelsen af de bundne proteiner uden biotinmærket. Dette sæt indeholder tilstrækkelige reagenser til otte eksperimenter, bestående af to 85-95% sammenflydende 15 cm skåle eller fire 75 cm ² kolber.

Celleoverfladeproteiner repræsenterer en vigtig undergruppe af cellulære proteiner og spiller store roller i signaltransduktion, celleadhæsion og iontransport. Disse proteiner er udfordrende at effektivt ekstrahere og isolere på grund af deres flere membranspændende domæner. Ofte resulterer de barske detergenter og betingelser, der er nødvendige for effektiv ekstraktion, i denaturering og kontaminering af plasmamembranproteiner efter isolering. Som et alternativ anvender dette kit et membranuigennemtrængeligt, aminreaktivt, sulfo-NHS-SS-biotin til effektivt at mærke celleoverfladeproteiner med tilgængelige lysiner. Lysis-, indfangnings-, vask- og elueringsbetingelserne er blevet optimeret til effektiv berigelse og isolering, mens kontaminering af intracellulære proteiner minimeres.

Protokollen er blevet optimeret til brug med forskellige pattedyrcellelinjer, herunder adhærente og suspensionsceller, og er nyttig til differentiel ekspressionsanalyse mellem behandlede og ikke-behandlede celler eller mellem en eller flere cellelinjer. Selektivitet og effektivitet af celleoverfladeproteinisoleringen er blevet verificeret ved western blotting og LC-MS-analyse.