Thermo Scientific™ Active Cdc42 Pull-Down og Detection Kit

Active GTPase Pull-Down og Detection Kits måler aktivering af små GTPaser ved at isolere dem via deres specifikke downstream effektorer. Der tilbydes kits, der er specifikke for Arf1, Arf6, Cdc42, Rac1, RalA, Rap1, Ras og Rho GTPaser. Det respektive bindingsdomæne af nedstrømseffektoren for hver lille GTPase udtrykkes som et GST-fusionsprotein. Når det er immobiliseret på en harpiks, bruges dette fusionsprotein til at trække den aktive (dvs. GTP-bundne) GTPase ned. Trinnet til pull-down affinitetsoprensning udføres let og bekvemt ved hjælp af mikrocentrifugespin-kolonner. Efter et simpelt vasketrin udvindes den bundne GTPase ved at eluere GST-fusionsproteinet fra glutathionharpiksen ved anvendelse af SDS-PAGE-prøvepåfyldningsbuffer. Den oprensede GTPase detekteres derefter ved Western blot under anvendelse af et specifikt antistof leveret i hvert kit.

Hvert GTPase-kit inkluderer GST-fusionsprotein fra det specifikke bindingsdomæne, γGTP S- og GDP-aktivatorer, glutathionagaroseharpiks, lysis-bindende vaskebuffer, primært antistof, 2X SDS-prøvebuffer, spinsøjler og opsamlingsrør. Hvert kit indeholder tilstrækkelige komponenter til 30 pull-down assays. Sættene er optimeret til Western blot-detektion med et HRP-konjugeret sekundært antistof (del nr. 31460, kanin; del nr. 31430, mus) vha. Thermo Scientific SuperSignal™ Vest Pico Kemiluminescerende substrat (del nr. 34080).

Højdepunkter:

• Høj følsomhed og nøjagtighed– optimerede reagenser, specifikke antistoffer og Western blot-procedure sikrer nøjagtige kontroller og kvantitative resultater

• Bekvemmelighed– ingen grund til at udtrykke og oprense dine egne GST-PBD- eller RBD-fusionsproteiner eller bruge dyre antistofbaserede immunpræcipitationsaffinitetsharpikser

• Hastighed– samtidig inkubation af cellelysat med GST-PBD eller RBD og glutathionharpiksen direkte i en højtydende mikrocentrifugespinkolonne

• Brugervenlighed– reagenser og nedtræksbetingelser er blevet optimeret til øjeblikkelig succes, selv for førstegangsbrugere

• Effektivitet– mikrocentrifugesøjlerne og opsamlingsrørene giver effektiv adskillelse af væske og harpiks, hvilket forhindrer prøvetab

• Komplet– kits inkluderer reagenser til affinitetsoprensning samt kontroller, en kompatibel cellelysebuffer og specifikt primært antistof til endelig Western blot-detektion

GST fusionsproteiner af aktive GTPase-bindende domæner:

• Raf1 Ras-bindende domæne (Raf1-RBD) binder aktivt Ras
• Pak1 p21-bindende domæne (Pak1-PBD) binder aktive Rac1 og Cdc42
• Rhotekin Rho-bindende domæne (Rhotekin-RBD) binder aktivt Rho
• RalGDS Rap1-bindende domæne (RalGDS-RBD) binder aktivt Rap1
• GGA3-proteinbindende domæne (GGA3-PBD) binder aktive Arf1 og Arf6
• Ral-bindende protein 1 (RalBP1) binder aktivt RalA

Inkluderer:

GST fusionsprotein af specifikt bindingsdomæne, glutathion-agarose-harpiks, GTP γS og GDP (100X), lysis-bindende vaskebuffer, GTPase-specifikt primært antistof, SDS-PAGE prøvebelastningsbuffer (2X), spinsøjler og opsamlingsrør