Multi-Copy Pichia Expression Kit

• Multi-Copy Pichia Expression Kit indeholder pPIC3.5K-, pPIC9K- og pAO815-vektorerne til produktion og udvælgelse af Pichia- stammer, der indeholder mere end én kopi af genet af interesse
• I mange tilfælde har øget kopiantal ført til øgede udtryksniveauer
• Disse vektorer er også tilgængelige separat

pPIC9K og pPIC3.5K

• pPIC9K- og pPIC3.5K-vektorerne bærer kanamycinresistensgenet, der bibringer resistens over for Geneticin™ Reagens i Pichi a
• Spontan generering af multiple insertionshændelser kan identificeres ved resistens over for øgede niveauer af Geneticin™ Reagens
• Pichia- transformanter selekteres på histidin-deficient medium og screenes for deres niveau af resistens over for Geneticin™ Reagens
• Evnen til at vokse i høje koncentrationer af Geneticin™ indikerer, at flere kopier af kanamycinresistensgenet og genet af interesse er integreret i genomet
• pPIC9K-vektoren styrer sekretion af udtrykte proteiner, mens proteiner udtrykt fra pPIC3.5K forbliver intracellulære.

pAO815

• pAO815 er en Pichia- ekspressionsvektor designet til at klone flere kopier af et gen ind i en enkelt vektor
• Vektoren indeholder et Bgl II-sted opstrøms for 5´AOX1 -gen og et unikt Ba mH I-sted nedstrøms for 3´AOX1- transskriptionstermineringssignal (TT).
• Fire trin er nødvendige for at generere flere kopier af genet af interesse:
  • 1. Genet klones ind i det unikke Ec oRI-sted i vektoren.
  • 2. Konstruktionen fordøjes med Ba mH I og Bgl II for at frigive“ udtrykskassette” indeholdende AOX1- promotoren, genet af interesse og 3´AOX1 TT.
  • 3. Concatemerer af ekspressionskassetten genereres ved ligering in vitro .
  • 4. De multiple kopier indsættes tilbage i pAO815 vektoren og transformeres til Pichi a.