Thermo Scientific™ Massespektrometri spaltelige tværbindere

DSSO (disuccinimidyl sulfoxide) og DSBU (disuccinimidyl dibutyric urea eller BuUrBU) er begge massespektrometri (MS)-spaltelige og membran-semi-permeable tværbindere, der indeholder en amin-reaktiv N-hydroxysuccinimid (NHS) ester i hver ende af et 7-carbon-arm-rum (1-carbon-DSSO)-arm (1 DSSOr-mellemrum). Begge tværbindere har en reaktivitet svarende til DSS, men indeholder en spaltelig funktionalitet i linkerregionen, der muliggør spaltning i gasfasen ved brug af kollisionsinduceret dissociation (CID) under tandem MS (MS/MS) fragmentering. MS-spaltning af DSSO eller DSBU genererer diagnostiske ion-dubletter under MS2, som adskiller identifikation af tværbundne peptider fra blindgydemodifikationer. De tværbundne peptidfragmenter identificeres efterfølgende ved hjælp af MeroX- eller XlinkX-software. For DSBU fragmenteres og sekventeres tværbundne peptider under MS2, mens tværbundne peptider for DSSO fragmenteres under MS/MS og kræver yderligere fragmentering (MS3) for at lette peptidsekventering ved brug af traditionelle databasesøgemaskiner.

Funktioner af MS-spaltelige tværbindere DSSO og DSBU
• Meget reaktiv NHS-ester (i begge ender) med primære aminer
• MS-spaltbar ved kollisionsinduceret dissociation (CID)
• Krystallinske reagenser med høj renhed til proteinstruktur og interaktionskarakterisering
• Membran-semi-permeabel, tillader intracellulær tværbinding
• Vanduopløselig (opløses først i DMF eller DMSO)

Fordele ved MS-spaltelige tværbindere
Selvom både ikke-spaltelige og MS-spaltelige tværbindere kan bruges til at studere protein-protein-interaktioner, kan MS-spaltelige tværbindere være mere fordelagtige til at forbedre identifikation og analyse af tværbundne peptider. Typisk, når der anvendes ikke-spaltelige tværbindere, består de genererede data af både de tværbundne og ikke-tværbundne peptider, hvilket gør det vanskeligt at skelne ved hjælp af massespektrometrianalyse. Ikke-spaltelige tværbindere øger også kompleksiteten af analysen. En vis kompleksitet kan reduceres gennem yderligere prøveforberedelse eller gennem isotopmærkning. MS-spaltelige tværbindere giver mulighed for at skelne mellem tværbundne og ikke-tværbundne peptider til analyse. Tværbinderen spaltes gennem kollisionsinduceret dissociation (CID/HCD) eller elektronoverførselsinduceret dissociation (ETD) for at generere karakteristiske ioner, som derefter kan anvendes under MS2- eller MS2/MS3-fragmentering til sikker identifikation og sekvensering af tværbundne peptider. Evnen til utvetydigt at identificere tværbundne peptider resulterer i færre falske positive sammenlignet med ikke-spaltelige tværbindere. DSSO og DSBU anvender henholdsvis et sulfoxid eller urinstof til spaltning med gasfasefragmentering.

Anvendelser for MS-spaltelige tværbindere DSSO og DSBU
• Analyse af komplekse proteinblandinger
• Profilering af native protein-protein-netværk in vivo
• Undersøgelse af intakte organeller, celler eller væv
• Udførelse af proteom-dækkende undersøgelser
• Karakterisering af intermolekylære proteininteraktioner
• Karakterisering af oprensede proteiner og komplekser

Note: Til højopløsningsanalyse af de tværbundne peptider er den anbefalede LC-søjle for Nanospray Flex-kilden Acclaim PepMap 100 C18 LC-søjle (kat. nr. 164940 eller 164568). For EASY-Spray-kilden er den anbefalede LC-kolonne EASY-Spray C18 LC-kolonnen (kat. nr. ES900 eller ES904).