Invitrogen™ LiveBLAzer™ FRET-B/G Loading Kit med CCF4-AM

Baggrund:
GeneBLAzer™ cellebaserede assays anvender de membrangennemtrængende esterformer (CCF2-AM og CCF4-AM) af de negativt ladede fluorescerende beta-lactamase-substrater, CCF2 og CCF4. Disse lipofile estere kommer let ind i cellen, hvor spaltning af endogene cytoplasmatiske esteraser hurtigt omdanner dem til deres negativt ladede former, hvorved de fanges i cytosolen.

Påvisning af GeneBLAzer™ assays er FRET-baserede. Hvert substrat er mærket med to fluoroforer, der danner et effektivt FRET-par. I fravær af beta-lactamase-aktivitet resulterer excitering af coumarin ved 409 nm i det intakte CCF2-molekyle i FRET til fluoresceinet, som udsender et grønt fluorescenssignal ved 518 nm (figur 1). I nærvær af beta-lactamase-aktivitet adskiller spaltning af CCF2 imidlertid de to farvestoffer rumligt og forstyrrer FRET, så excitering af cumarinet ved 409 nm nu producerer et blåt fluorescenssignal ved 447 nm. Dette blå signal kan let observeres under et mikroskop og kan også detekteres som en stigning i den blå kanaludlæsning på fluorescerende mikropladelæsere.

CCF2-AM- og CCF4-AM-substraterne er essentielle assaykomponenter for GeneBLAzer™ platform. Disse substrater er fuldt ud kompatible med flowcytometri, hvilket fremskynder tiden til klonselektion. Ratiometrisk analyse af de blå og grønne signaler reducerer brønd til brønd variation på grund af forskelle i celleantal og substratbelastning, hvilket fører til høj Z´ -faktorværdier og lave variationskoefficienter (CV'er).

CCF2-AM og CCF4-AM adskiller sig med to carbonatomer i broen, der forbinder coumarindelen til lactamringen. Begge er i de membrangennemtrængelige, esterificerede former og kan bruges til assays i intakte celler. CCF4-AM har bedre opløselighedsegenskaber (opløselig for> 24 timer) end CCF2-AM og er dermed bedst egnet til screeningsapplikationer. Derudover har CCF4-AM lidt bedre FRET og dermed lidt lavere baggrund end CCF2-AM.

CCF2-FA er i det væsentlige CCF2-substratet uden de estere, der findes i AM-versionen. CCF2-FA de-esterificeres og bruges i cellelysatapplikationer, idet den omgår belastning over cellemembranen og de-esterificeringstrin. Cellelysater er den foretrukne metode til anvendelser med celler, der indeholder en cellevæg. CCF2-FA kan også bruges som en kontrol til at erhverve excitations- og emissionsspektrene for CCF2-AM og CCF4-AM.