Thermo Scientific™ LanthaScreen™ STAT1 U2OS cellelinje

Beskrivelse

JAK/STAT1 signalvejen er kendt for at blive aktiveret af type I/II interferoner såsom interferon-gamma og interferon-alfa. På denne vej resulterer binding af disse cytokiner til deres respektive celleoverfladereceptorer i aktiveringen af JAK'er, som igen phosphoaktiverer STAT1-proteiner ved en specifik tyrosinrest (Y701). LanthaScreen™ STAT1 U2OS er en human cellelinje, der konstitutivt udtrykker et GFPSTAT1-fusionsprotein. JAK/STAT1-signalvejen er kendt for at være funktionelt intakt i denne cellelinje; derfor tjener GFP-STAT1-fusionsproteinet som et substrat for den IFN-gamma-inducerbare phosphorylering af JAK'er. Ved hjælp af denne cellelinje er der udviklet et homogent immunassay, hvor phosphoryleringstilstanden af GFP-STAT1 påvises i cellelysater under anvendelse af et terbium-mærket anti-pY701-STAT1 antistof i en tidsopløst FRET (TR-FRET) udlæsning. GFP-STAT1 DNA-ekspressionskonstruktionen blev transficeret ind i U2OS-celler under anvendelse af Lipofectamine™ LTX Reagens, efterfulgt af udvælgelse med blasticidin.

Denne cellelinje er en klonal population isoleret ved flowcytometri under anvendelse af GFP-fluorescens som en sorteringsmarkør. Ved hjælp af det lytiske TR-FRET-immunoassay valideres denne cellelinje for EC50- og Zfi-faktorer under optimerede betingelser ved anvendelse af IFN-gamma som en ligand til JAK-medieret GFP-STAT1-phosphorylering. Dette assay er også blevet testet for assay-ydeevne under variable eksperimentelle betingelser, herunder cellepladerdensitet, stimuleringstid, DMSO-tolerance og assay-udviklingstid. Yderligere information ved hjælp af alternative stimuli og alternative assayprotokoller er tilgængelig.