Thermo Scientific™ LanthaScreen™ PRAS40 293E cellelinje

PI3K/AKT-vejen aktiveres af forskellige stimuli (herunder insulin og IGF-1) og medierer signaler for cellevækst, celleoverlevelse, translation og inhibering af apoptose. PRAS40 (Prolin-rigt AKT-substrat, 40 kDa) er et cytosolisk protein, der phosphoryleres i position Thr246 af AKT direkte ved stimulering af pathwayen. PRAS40 har vist sig at binde til mTORC1-komplekset og hæmme downstream-signalering (dvs. phosphorylering af 4E-BP1 eller p70S6K). LanthaScreen™ PRAS40 HEK293E er en human cellelinje, som konstitutivt udtrykker GFP-PRAS40 fusionsproteiner.

Kinasesubstratet blev indført under anvendelse af lentiviral transduktion efterfulgt af selektion med blasticidin. Denne cellelinje er en klonal population isoleret ved flowcytometri under anvendelse af GFP-fluorescens som en sorteringsmarkør. PI3K/AKT-vejen er kendt for at være aktiv i den meget insulin-responsive HEK293E-cellebaggrund. Ved at bruge denne cellelinje er der udviklet et homogent ('kun tilsætning') immunoassay i et 384-brønds format. Fosforyleringen af PRAS40 ved Thr246 påvises i cellelysater under anvendelse af et terbium-mærket phosphospecifikt antistof i en tidsopløst FRET (TR-FRET) udlæsning.

Ydeevnen af dette assay er blevet testet ved hjælp af adskillige eksperimentelle variabler, herunder cellepladerdensitet, stimuleringstid, DMSO-tolerance og antistofinkubationstid. Under optimerede forhold er assayet blevet yderligere valideret og viser korrekte EC ₅₀ og IC ₅₀ værdier, med insulin som den primære agonist og PI-103 som den kendte hæmmer. Samlet set viser analysen fremragende statistiske data (Z'-faktor> 0,6), højt signal-til-baggrund (responsforhold), og er en robust cellebaseret udlæsning af AKT-signalering.