Thermo Scientific™ LanthaScreen™ ERK2 A375 cellelinje

Map Kinase (MapK) signaltransduktionskaskaden aktiveres af vækstfaktorer såsom EGF, PDGF og HGF. Binding af disse faktorer til deres respektive celleoverfladereceptorer resulterer i initieringen af receptortyrosinkinaseaktivitet, hvilket fører til den sekventielle phospho-aktivering af nedstrøms kinaser såsom Ras, Raf, MEK og Erk 1/2. Aktiveret MEK phosphorylerer Erk2 (Mapk1) proteiner ved et specifikt Thr-Tyr motiv (Thr/Tyr 185/187). En række konstitutive aktive kinasemutanter inden for MAP-kinasevejen er blevet impliceret i onkogenese. En af disse mutanter er BRAF(V600E), som er den mest fremherskende onkogene BRAF-mutant. Den humane melanomcellelinje A375 udtrykker endogent BRAF(V600E), hvilket fører til den konstitutive aktivering af MAP-kinasevejen og phosphorylering af Erk2 i fravær af ligander.

LanthaScreenTM Erk2 A375 udtrykker konstitutivt GFP-Erk2 under kontrol af en CMV-promotor. Ved hjælp af denne cellelinje er der udviklet et homogent immunassay, hvor phosphoryleringstilstanden af GFP-Erk2 påvises i cellelysater under anvendelse af et terbium-mærket anti-pTpY-185/187-Erk2 antistof i en tidsopløst FRET (TR-FRET) udlæsning. Denne cellelinje kan bruges til at evaluere forbindelsens aktivitet mod BRAF(V600E). GFP-Erk2 lentivirus blev transduceret til A375-celler efterfulgt af selektion med Blasticidin. Denne cellelinje er en klonal population isoleret ved flowcytometri under anvendelse af GFP-fluorescens som sorteringsmarkør. Ved hjælp af det lytiske TR-FRET-immunoassay valideres denne cellelinje for EC50 og Z' under optimerede betingelser ved anvendelse af EGF som en ligand til GFP-Erk2-phosphorylering. Dette assay er også blevet testet for assay-ydeevne under variable eksperimentelle betingelser, herunder celleudpladningstæthed, stimulationstid, DMSO-tolerance og cellelyse/ækvilibreringstid. Yderligere information ved hjælp af alternative stimuli og små molekylehæmmere er også tilvejebragt.