Invitrogen™ Image-iT™ Fixative løsninger

Image-iT Fixative Solutions er færdige fixeringsløsninger, der tilbydes i forskellige formater for at imødekomme forskellige forskningsbehov. De er ideelle til brug med fluorescerende proteiner, såsom GFP og RFP, samt andre små farvestoffluoroforer. Ikke mere blanding af giftige fikseringspulvere eller fortynding af koncentrerede opløsninger med ikke-optimal pH. Tilsæt blot disse fikseringsopløsninger til celler/væv og inkluder i 10-15 minutter ved stuetemperatur. De er ideelle til brug med enhver antistofbaseret påvisningsmetode, herunder immunocytokemi (ICC), immunofluorescens (IF) og immunohistokemi (IHC).

Funktioner ved Image-iT fixative løsninger inkluderer:

• Brugsklar
• Højrenhed, billeddannelseskvalitetsfixativer med minimale baggrundssignalartefakter
• Methanolfri
• Optimeret til sekundær antistofmærkning, farvning af fastcellefarve og kolorimetrisk IHC

4% formaldehyd eller paraformaldehyd fixative løsninger

4% formaldehyd og paraformaldehyd er de mest anvendte fixativer til immunocytokemi (ICC), immunofluorescens (IF) og immunohistokemi (IHC). Image-IT™ Paraformaldehyd 4% i 0,1M fosfatbuffer pH 7,4 (Kat. Nej. I28800), leveres i en pakke med ti hætteglas på 10 ml hver. Image-iT™ Formaldehyd 4% i PBS gives i 20 ml størrelser (Cat. Nej. FB002) eller 5 x 20 ml størrelse (Cat. Nr. R37814). Paraformaldehyd/formaldehyd 4% i 0,1 M fosfatbuffer har ∼300 mOsm mindre osmolaritet end i PBS, hvilket hjælper med at opretholde cellens morfologi, før fixatoren får mulighed for at fiksere de indre cellulære rum. For paraformaldehyd/formaldehyd i PBS eller fosfatbuffer, tilsæt blot fixativet til cellerne og inkuber i 5-10 minutter ved stuetemperatur. Vask cellerne i PBS efter inkubation og fortsæt til blokeringstrinnet.

Paraformaldehyd 3%, glutaraldehyd 0,35% fixativ opløsning

3% paraformaldehyd med 0,35% glutaraldehyd er en færdig opløsning, der leveres i en methanolfri, 0,1 M natriumkakodylatbuffer. Yuan Qin et al. (1) fandt, at en blanding af paraformaldehyd og glutaraldehyd kan bevare mitokondriemorfologien bedre end nogen af dem alene.

Paraformaldehyd er et lille molekyle, der hurtigt trænger ind i celler/væv og fastholder proteiner og andre molekyler på plads. Glutaraldehyd er et større molekyle med to reaktive aldehydgrupper, som øger potentialet for fiksering og hjælper med at skabe lange kæder af glutaraldehyd, hvilket danner en matrix. Denne evne hjælper med at bevare lokaliseringen af proteiner i komplekse miljøer som mitokondrier.

For at reparere celler/væv anbefales 5-10 –minutters inkubation ved stuetemperatur. Med glutaraldehyd kan øget autofluorescens observeres på grund af øget tilstedeværelse af reaktive aldehydgrupper. For at hjælpe med at reducere denne autofluorescens anbefales cirka syv minutters inkubation med 0,1 mil. glycin eller friskforberedt 0,1% (med vægt) natriumborhydrid efter fiksering, men før blokering.

Glyoxal 3% fikserende opløsning

Glyoxal er et mindre molekyle end formaldehyd eller glutaraldehyd. Det trænger hurtigt ind i celler/væv, fikserer proteinerne og bevarer cellens morfologi bedre end formaldehyd (2). Glyoxal 3% fikseringsopløsning er en færdig fikseringsopløsning, der leveres i to separate flasker: Komponent A (92 ml) og Komponent B (8 ml), som indeholder absolut ethanol, glyoxalopløsning, eddikesyre og vand. Bland opløsning A og opløsning B i en tom flaske, vortex de to opløsninger sammen og bring en pH på 4,5 med tilsætning af 1M NaOH. Når opløsningen er blandet, skal den bruges med det samme. For at fikse celler/væv, inkubér celle/væv ved stuetemperatur i cirka 10 minutter.

Referencer

1. Qin Y, Jiang W, Li A, Gao M, Liu H, Gao Y, Tian X, Gong G. Kombinationen af paraformaldehyd og glutaraldehyd er et potentielt fikseringsmiddel for mitokondrier. Biomolekyler. 10. maj 2021; 11(5):711.
2. Richter KN m.fl. Glyoxal som et alternativt fikseringsmiddel til formaldehyd i immunfarvning og superopløsningsmikroskopi. EMBO J. 2018 4. jan; 37(1):139-159.