Thermo Scientific™ Image-iT™ Fixative løsninger

Image-iT Fixative Solutions er klar-til-brug fikseringsløsninger, der leveres i forskellige formater for at imødekomme en række forskellige forskningsbehov. De er ideelle til brug med fluorescerende proteiner, såsom GFP og RFP, og andre små farvestoffluoroforer. Ikke mere blanding af giftige fikseringspulvere eller fortynding af koncentrerede opløsninger med ikke-optimal pH. Bare tilsæt disse fikserende opløsninger til celler/væv og inkuber i 10-15 minutter ved stuetemperatur. De er ideelle til brug med enhver antistofbaseret detektionsmetode, herunder immuncytokemi (ICC), immunfluorescens (IF) og immunhistokemi (IHC).

Funktioner af Image-iT Fixative løsninger omfatter:
• Klar til brug
• Fikseringsmidler af høj renhed i billeddannelsesgrad med minimale baggrundssignalartefakter
• Methanol-fri
• Optimeret til sekundær antistofmærkning, fastcellet farvestoffarvning og kolorimetrisk IHC

4 % formaldehyd eller paraformaldehyd fikseringsopløsninger
4 % formaldehyd og paraformaldehyd er de mest almindeligt anvendte fikseringsmidler til immuncytokemi (ICC), immunfluorescens (IF) og immunhistokemi. Image-IT™ Paraformaldehyd 4 % i 0,1 M fosfatbuffer pH 7,4 (kat. nr. I28800), leveres i ti hætteglaspakninger med hver 10 ml. Image-iT™ Formaldehyd 4 % i PBS leveres i 20 ml størrelse (kat. nr. FB002) eller 5 x 20 ml størrelse (kat. nr. R37814). Paraformaldehyd/formaldehyd 4 % i 0,1 M fosfatbuffer har∼ 300 mOsm mindre osmolaritet end i PBS, hvilket hjælper med at opretholde cellulær morfologi, før fikseringsmidlet har en chance for at fiksere de indre cellulære rum. For paraformaldehyd/formaldehyd i PBS eller fosfatbuffer skal du blot tilføje fikseringsmidlet til cellerne og inkubere i 5-10 minutter ved stuetemperatur. Vask cellerne i PBS efter inkubation og fortsæt til blokeringstrinnet.

Paraformaldehyd 3 %, glutaraldehyd 0,35 % fikseringsopløsning
3 % paraformaldehyd med 0,35 % glutaraldehyd er en klar-til-brug opløsning, der leveres i methanolfri, 0,1 M natriumcacodylatbuffer. Yuan Qin, et al. (1) fandt ud af, at en blanding af paraformaldehyd og glutaraldehyd kan bevare mitokondriel morfologi bedre end begge alene.

Paraformaldehyd er et lille molekyle, der hurtigt trænger ind i celler/væv og fikserer proteiner og andre molekyler på plads. Glutaraldehyd er et større molekyle med to reaktive aldehydgrupper, der øger potentialet for fiksering og hjælper med at skabe lange kæder af glutaraldehyd, der genererer en matrix. Denne evne hjælper med at bevare lokalisering af proteiner i komplekse miljøer såsom mitokondrier.

For at fiksere celler/–væv anbefales 5 10 minutters inkubation ved stuetemperatur. Med glutaraldehyd kan øget autofluorescens observeres på grund af øget tilstedeværelse af reaktive aldehydgrupper. For at hjælpe med at reducere denne autofluorescens anbefales ca. syv minutters inkubation med 0,1 M glycin eller frisklavet 0,1 % (w/v) natriumborhydrid efter fiksering, men før blokering.

Glyoxal 3% fikseringsopløsning
Glyoxal er et mindre molekyle end formaldehyd eller glutaraldehyd. Det trænger hurtigt ind i celler/væv, fikserer proteinerne og bevarer den cellulære morfologi bedre end formaldehyd (2). Glyoxal 3% fikseringsopløsning er en klar-til-brug fikseringsopløsning, der leveres i to separate flasker: Komponent A (92 ml) og komponent B (8 ml), der indeholder absolut ethanol, glyoxalopløsning, eddikesyre og vand. Bland opløsning A og opløsning B i et tomt hætteglas, vortex de to opløsninger sammen og bring til en pH på 4,5 med tilsætning af 1 M NaOH. Når den er blandet, skal denne opløsning bruges med det samme. For at fiksere cellerne/vævet inkuberes celle/væv ved stuetemperatur i ca. 10 minutter.

Referencer
1: Qin Y, Jiang W, Li A, Gao M, Liu H, Gao Y, Tian X, Gong G. Kombinationen af paraformaldehyd og glutaraldehyd er et potentielt fikseringsmiddel for mitokondrier. Biomolekyler. 10. maj 2021;11(5):711.
2: Richter KN, et al. Glyoxal som et alternativ fikseringsmiddel til formaldehyd i immunfarvning og superopløsningsmikroskopi. EMBO J. 4. januar 2018;37(1):139-159.