Invitrogen™ EasySelect™Pichia-ekspressionssæt

EasySelect™Pichia-ekspressionssættet indeholder alle nødvendige komponenter til proteinproduktion i gæren Pichia pastoris. EasySelect™ Sættet indeholder Pichia gærstammer, ekspressionsvektorer og reagenser, der muliggør transformation af Pichia-celler. Udvælgelse med Zeocin™ antibiotikum gør det nemt at screene for transformerede varianter med højt antal kopier.

Fordele ved Pichia pastoris- ekspressionssystemet:

• Dyrk Pichia-celler så let som E. coli
• Opnå højere celledensitet end andre mikrobielle ekspressionssystemer.
• Generer mere protein pr. celle end andre mikrobielle ekspressionssystemer.
• Få gavn af eukaryot proteinbehandling, proteinfoldning og posttranslationelle modifikationer.
• Nem opskalering fra rystekolber til fermentering i industriel skala.

Et gennemprøvet proteinekspressionssystem
I løbet af de sidste 30 år, er Pichia pastoris blevet brugt af laboratorier og industri over hele verden til at producere hundredvis af forskellige proteiner fra mange arter, herunder mennesker (Ref 1, 2, 3). Pichia pastoris kan dyrkes lige så let som bakterier ( E. coli) eller gær ( Saccharomyces cerevisiae), men tilbyder mange fordele i forhold til disse systemer (Ref. 4). Pichia pastoris kan vokse til meget højere celledensiteter end bakterier eller anden gær. Pichia pastoris er i stand til at vokse på methanol som en eneste kulstofkilde, hvilket gør opskalering til industrielt niveau relativt billigt.

Styrken i AOX1-promotoren
EasySelect™Pichia-ekspressionssættet bruger promotoren fra Pichia alkoholoxidase 1 (AOX1) genet til at drive produktionen af dit protein. Pichia pastoris er i stand til at vokse på methanol som sin eneste kulstofkilde. Når det dyrkes på methanol som eneste kulstofkilde, repræsenterer AOX1-mRNA op til 5 % af det samlede mRNA, og AOX1-enzym kan være op til 30 % af cellevægten (Ref 5).

EasySelect™Pichia-ekspressionssystemet leveres med pPICZ og pPICZα-vektorer. pPICZ og pPICZα-vektorer indeholder et multiple kloningssted (MCS) og tillader indsættelse af dit gen af interesse under kontrol af AOX1-promotoren. pPICZ og pPICZα-vektorer indeholder også et c-Myc-mærke til nem påvisning og et polyhistidin-mærke (6xHis) til nem påvisning og oprensning af dit protein.

Da Pichia pastoris naturligt udskiller få proteiner, kan du bruge den ekstracellulære signalsekvens i pPICZα-vektorer til at tvinge sekretion af dit protein ind i dyrkningsmediet for at forenkle nedstrøms oprensning.

Få integration af højt kopital med Zeocin™-antibiotikum
EasySelect™Pichia-ekspressionssæt bruger Zeocin™-antibiotikum til at selektere for transformerede Pichia-celler. pPICZ og pPICZα-vektorer indeholder bleomycingenet fra Streptoalloteichus hindustanus (Sh ble), der giver resistens over for Zeocin™-antibiotikum. pPICZ og pPICZα-vektorer kan integreres stabilt i Pichia-genomet. Ved at øge koncentrationen af Zeocin™-antibiotikum, kan du nemt vælge kloner med det højeste antal integranter og højeste proteinekspressionsniveauer.

EasySelect™Pichia-ekspressionssæt indeholder følgende komponenter:

• Stik hætteglas med Pichia pastoris og E. coli- stammer til at starte dine kulturer.
• Løsninger til fremstilling af transformationskompetente Pichia-celler.
• pPICZ og pPICZα-vektorer til at fusionere dit gen til AOX1-promotoren.
• Sekventeringsprimere til bekræftelse af insertion af dit gen i pPICZ-vektorerne.
• Zeocin™-antibiotikum til udvælgelse af transformerede Pichia-celler.

Referencer
1. Cereghino JL, Cregg JM. Heterolog proteinekspression i den methylotrofiske gær Pichia pastoris. FEMS Microbiol Rev. 2000 Jan;24(1):45-66. [PubMed]

2. Cereghino GP, Cereghino JL, Ilgen C, Cregg JM. Produktion af rekombinante proteiner i fermenteringskulturer af gæren Pichia pastoris. Curr Opin Biotechnol. 2002 Aug;13(4):329-32. [PubMed]

3. Cregg JM. Introduktion: skel mellem Pichia pastoris og andre ekspressionssystemer. Metoder Mol Biol. 2007;389:1-10. [PubMed]

4. Cregg JM, Tolstorukov I, Kusari A, Sunga J, Madden K, Chappell T. Ekspression i gæren Pichia pastoris. Metoder Enzymol. 2009;463:169-89. [PubMed]

5. Cregg JM, Madden KR, Barringer KJ, Thill GP, Stillman CA. Funktionel karakterisering af de to alkoholoxidasegener fra gæren Pichia pastoris. Mol Cell Biol. 1989 Mar;9(3):1316-23. [PubMed]