Invitrogen™ EasySelect™Pichia-ekspressionssæt

Fordele ved Pichia pastoris- ekspressionssystemet:

• Dyrk Pichia-celler så let som E. coli
• Opnå højere celledensitet end andre mikrobielle ekspressionssystemer.
• Generer mere protein pr. celle end andre mikrobielle ekspressionssystemer.
• Få gavn af eukaryot proteinbehandling, proteinfoldning og posttranslationelle modifikationer.
• Nem opskalering fra rystekolber til fermentering i industriel skala.

Et gennemprøvet proteinekspressionssystem
I løbet af de sidste 30 år er Pichia pastoris blevet brugt af laboratorier og industri verden over til at producere hundredvis af forskellige proteiner fra mange arter, herunder mennesker (Ref 1, 2, 3). Pichia pastoris kan dyrkes lige så let som bakterier (E. coli) eller gær (Saccharomyces cerevisiae), men tilbyder mange fordele i forhold til disse systemer (Ref 4). Pichia pastoris kan vokse til meget højere celletæthed end bakterier eller anden gær. Pichia pastoris kan vokse på methanol som eneste kulstofkilde, hvilket gør opskalering til industrielt niveau relativt billigt.

Styrken i AOX1-promotoren
EasySelect™ Pichia Expression Kit bruger promotoren fra Pichia alcohol oxidase 1 (AOX1) genet til at drive produktionen af dit protein. Pichia pastoris kan vokse på methanol som sin eneste kulstofkilde. Når det dyrkes på methanol som eneste kulstofkilde, repræsenterer AOX1 mRNA op til 5% af det samlede mRNA, og AOX1-enzymet kan udgøre op til 30% af cellevægten (Ref 5).

EasySelect™ Pichia-ekspressionssystemet leveres med pPICZ- og pPICZ-vektorerne α. pPICZ- og pPICZ-vektorerne α indeholder et multipelt kloningssted (MCS) og muliggør indsættelse af dit gen af interesse under kontrol af AOX1-promotoren. pPICZ- og pPICZ-vektorerne α indeholder også et c-Myc-tag for nem påvisning og et polyhistidin (6xHis)-tag for nem påvisning og rensning af dit protein.

Da Pichia pastoris naturligt udskiller få proteiner, kan du bruge den ekstracellulære signalsekvens i pPICZα-vektorer til at tvinge sekretion af dit protein ind i dyrkningsmediet for at forenkle nedstrøms oprensning.

Få integration med højt kopinummer og Zeocin™ antibiotika
EasySelect™ Pichia Expression Kit anvender Zeocin™ antibiotikaet til at selektere for transformerede Pichia-celler. pPICZ- og pPICZ-vektorer α indeholder bleomycin-genet fra Streptoalloteichus hindustanus (Sh ble), som giver resistens over for Zeocin™ antibiotika. pPICZ- og pPICZ-vektorerne α kan stabilt integreres i Pichia-genomet. Ved at øge koncentrationen af Zeocin™ antibiotika kan man nemt selektere kloner med det højeste antal integranter og højeste proteinekspressionsniveauer.

EasySelect™ Pichia Expression Kit indeholder følgende komponenter:

• Stik hætteglas med Pichia pastoris og E. coli- stammer til at starte dine kulturer.
• Løsninger til fremstilling af transformationskompetente Pichia-celler.
• pPICZ og pPICZα-vektorer til at fusionere dit gen til AOX1-promotoren.
• Sekventeringsprimere til bekræftelse af insertion af dit gen i pPICZ-vektorerne.
• Zeocin™ antibiotika til selektion af transformerede Pichia-celler .

Referencer

1. Cereghino JL, Cregg JM. Heterologt proteinudtryk i den methylotrofe gær Pichia pastoris. FEMS Microbiol Rev. 2000 jan; 24(1):45-66. [PubMed]
2. Cereghino GP, Cereghino JL, Ilgen C, Cregg JM. Produktion af rekombinante proteiner i fermenterkulturer af gæren Pichia pastoris. Curr Opin Biotechnol. 2002 august; 13(4):329-32. [PubMed]
3. Cregg JM. Introduktion: skel mellem Pichia pastoris og andre udtrykssystemer. Metoder Mol Biol. 2007;389:1-10. [PubMed]
4. Cregg JM, Tolstorukov I, Kusari A, Sunga J, Madden K, Chappell T. Udtryk i gæren Pichia pastoris. Metoder Enzymol. 2009;463:169-89. [PubMed]
5. Cregg JM, Madden KR, Barringer KJ, Thill GP, Stillman CA. Funktionel karakterisering af de to alkoholoxidase-gener fra gæren Pichia pastoris. Mol Cell Biol. 1989 mar; 9(3):1316-23. [PubMed]