Invitrogen™ Click-iT™ Plus TUNEL-analysesæt til in situ-apoptosedetektion

De Click-iT Plus TUNEL Alexa Fluor 488, 594 og 647 assays til in situ apoptose detektion kan detektere apoptotiske celler i væv og dyrkede celleprøver gennem inkorporering af en lille, meget specifik mærkningsdel og et klart fluorescerende farvestof. Efter inkorporering af mærkningsdelen i DNA-fragmenter opnås detektion gennem en katalyseret ''klik''-reaktion under anvendelse af betingelser milde nok til at bevare det udsendte fluorescerende signal fra GFP eller RFP.

Andre fordele ved Click-iT Plus TUNEL-analyse til in situ-apoptosedetektion inkluderer:
•Optimeret til påvisning af apoptotiske celler i enten vævs- eller celleprøver
• Multiplex aktiveret —optimeret til at arbejde med fluorescerende farvestoffer eller proteiner såsom GFP og RFP
• Forbedret TUNEL-assay —bedre inkorporering af mærker på grund af lille reaktiv del
• Lyse apoptotisk —signal bruger Alexa Fluor farvestoffer, hvilket resulterer i et stabilt, ikke-fotoblegende fluorescerende signal
• Fleksibilitet —analysen kan konfigureres til at teste 1 –50 prøver ad gangen

Fragmentering af cellulært DNA er et kendetegn for apoptose. TUNEL-analysen er den mest udbredte metode til at påvise fragmenteret DNA i apoptotiske celler eller vævsprøver. TUNEL-analysen begynder med inkorporering af modificeret dUTP i 3'-OH-enden af det fragmenterede DNA. dUTP-modifikationen er ofte tilføjelsen af en fluorofor. På grund af størrelsen af fluoroforen kan den modificerede dUTP vise lavere end forventet inkorporeringshastigheder, hvilket kan påvirke følsomheden af TUNEL-analysen. Derudover lider mange fluoroforer, der anvendes i aktuelt tilgængelige TUNEL-assay-kits, af fotoblegning og fluorescerende spektrale overlapningsproblemer, som begge reducerer følsomheden af og evnen til at multiplekse analysen.

De Click-iT Plus TUNEL assay blev udviklet til at løse disse problemer. Assayet bruger dUTP modificeret med en alkyngruppe (en lille bio-ortogonal funktionel gruppe), hvilket gør det muligt at inkorporere nukleotidet lettere. Efter inkorporering, en meget specifik klikreaktion mellem alkyngruppen og en Alexa Fluor picolylazid fluorescerende farvestof og efterfølgende påvisning af dette farvestof resulterer i et følsomt og specifikt assay til påvisning af apoptotiske celler eller vævsprøver. På grund af dets blide reaktionsforhold, Click-iT Plus TUNEL assay muliggør multipleksing med fluorescerende proteiner eller farvestoffer.

De Click-iT Plus TUNEL assay er blevet valideret med flere forskellige formalinfikserede paraffinindlejrede vævstyper. I alle tilfælde blev dens evne til at multiplekse med fluorescerende proteiner og farvestoffer bevaret. Derudover blev evnen til at farve actin ved hjælp af fluorescens-mærket phalloidin også bevaret.

De Click-iT Plus TUNEL-analysen indeholder alle de reagenser, der er nødvendige for at detektere apoptotiske celler fra enten vævs- eller celleprøver. Reagenserne, der leveres i dette sæt, kan bruges til at teste 50 prøver og kan konfigureres til at teste 1 –50 prøver ad gangen.