Invitrogen™ Click-iT™ EdU-proliferationsanalyse for mikroplader

Efter inkorporering af EdU (en modificeret thymidinanalog) i nysyntetiseret DNA, bindes peberrodsperoxidase (HRP) kovalent via den meget specifikke klikreaktion. Amplex UltraRed Reagent, et HRP-substrat, tilsættes derefter, og det resulterende fluorescenssignal detekteres. På grund af den meget specifikke binding af HRP til EdU, resulterer denne analyse i meget følsom og pålidelig måling af pattedyrcelleproliferation i et mikropladeformat.

Click-iT EdU Proliferation Assay for Microplates funktioner omfatter:
• Forbedret ydeevne —direkte konjugering af HRP til inkorporeret EdU forbedrer assayfølsomhed og nøjagtighed
•Øget pålidelighedsanalyseformat —resulterer i lav brønd-til-brønd-variabilitet
•Forenklet protokol resulterer —i reduceret tid til data; nemmere at følge protokollen
•Multiplex-aktiveret assay —kan nemt multiplekses med andre cellesundhedsreagenser, hvilket resulterer i flere data pr. prøve. Måling af celleproliferation

er en grundlæggende metode til vurdering af cellesundhed, bestemmelse af genotoksicitet og evaluering af lægemidler mod kræft. Den mest nøjagtige metode til at måle proliferation er ved direkte påvisning af DNA-syntese. Oprindeligt blev dette opnået gennem inkorporering af et radioaktivt nukleosid (f.eks. ^3H -thymidin). Denne metode blev erstattet af antistof-baseret påvisning af nukleosidanalogen brom-deoxyuridin (BrdU). Efter inkorporering af BrdU i det nyligt syntetiserede DNA kræves denaturering for at udsætte BrdU-molekylerne for anti-BrdU-antistoffet. Denatureringen involverer barske metoder (HCl, varme eller enzymer) og er tidskrævende og vanskelig at udføre konsekvent.

De Click-iT EdU Proliferation Assay er et alternativ til BrdU-analysen. Nukleosidanalogen EdU (5-ethynyl-2´ -deoxyuridin) tilsættes til levende celler og inkorporeres i DNA under aktiv DNA-syntese. Den inkorporerede EdU indeholder en alkyngruppe, som er kovalent forbundet med azidgruppen, der er til stede i HRP, ved hjælp af en meget specifik kobberkatalyseret kovalent reaktion ('klikreaktion'). Amplex UltraRed Reagent tilsættes derefter, og dets omdannelse ved hjælp af HRP til et stærkt fluorescerende produkt registreres ved hjælp af en fluorescens mikropladelæser (excitation: 568, emission: 585 nm). Med en høj ekstinktionskoefficient, god kvanteeffektivitet og modstandsdygtighed over for autooxidation, Amplex UltraRed Reagent leverer højere følsomhed og et bredere analyseområde end andre fluorogene eller kolorimetriske HRP-substrater. Det tilbyder også alsidighed gennem detektion ved enten fluorescens- eller absorbansmåling.