Thermo Scientific™ CellSensor™ irf1- bla TF-1 cellelinje

Jak/Stat signalveje spiller væsentlige roller i cellulære responser på forskellige cytokiner. En af Jak/Stat-vejene, Jak2/Stat5, medierer celleproliferation som reaktion på Interleukin-3 (IL-3), prolactin, erythropoietin (Epo) og granulocyt-makrofage-kolonistimulerende faktor (GM-CSF). JAK2-gen-knockout forårsager embryonal dødelighed på grund af defekt erytropoiese, hvilket tyder på, at Jak2/Stat5-vejen spiller en vigtig rolle i dannelsen af røde blodlegemer.

Den nylige opdagelse af en aktiverende mutation i JAK2 (V617F) til stede i en høj procentdel af myeloproliferative sygdomspatienter (MPD) tyder på, at Jak2/Stat5-vejen kan være et potentielt terapeutisk mål for visse former for MPD. Den aktiverede Stat5-transkriptionsfaktor genkender og binder sig til en specifik palindromisk DNA-sekvens fundet i promotorregionen afβ -kasein, interferon regulatorisk faktor-1 (irf-1) og en række andre gener. De CellSensor™ irf1-bla TF1-cellelinje indeholder et beta-lactamase-reportergen under kontrol af irf-1-responselementet stabilt integreret i TF1-celler. TF1-celler er en human erythroleukæmi-cellelinje, der er vækstafhængig af GM-CSF og har en intakt GM-CSF-JAK2-STAT5-vej.

Denne cellelinje er valideret for _EC50 og Z'-faktor ved anvendelse af GM-CSF. Denne cellelinje er også blevet testet under variable eksperimentelle betingelser, herunder DMSO-koncentration, celleantal, stimulationstid og substratladningstid. Reaktionsevne over for EPO og Jak Inhibitor 1 blev også testet (figur 2 og 3). CellSensor™ irf1-bla TF1-celler blev stimuleret i tre eksemplarer med GM-CSF over det angivne koncentrationsområde i et 384-brønds format. Celler blev inkuberet i 5 timer. med agonist og 0,5 % DMSO og derefter kombineret med LiveBLAzer™ -FRET B/G-substrat (CCF4-AM) i 2,5 timer. Fluorescensemissionsværdier ved 460 nm og 530 nm blev opnået ved anvendelse af en standard fluorescenspladelæser. 460/530-forholdene blev plottet for hver replikat mod de angivne koncentrationer af GM-CSF. CellSensor™ irf1-bla TF1-celler blev stimuleret med Epo over det angivne koncentrationsområde i et 384-brønds format.

Responsforholdet blev plottet mod de angivne koncentrationer af Epo. CellSensor™ irf1-bla TF1-celler blev behandlet med Jak Inhibitor 1 over det angivne koncentrationsområde i et 384-brønds format. Celler blev derefter stimuleret med GM-CSF eller EPO i 5 timer. i 0,5 % DMSO og derefter kombineret med LiveBLAzer™ -FRET B/G-substrat (CCF4 - AM) i 2,5 timer. Fluorescensemissionsværdier ved 460 nm og 530 nm blev opnået ved anvendelse af en standard fluorescenspladelæser. Disse værdier blev konverteret til procent inhibering i forhold til et sæt kontroller (ustimulerede celler og EC80 af GM-CSF eller EPO-behandlede celler) og plottet mod de angivne koncentrationer af Jak Inhibitor 1.

Akademiske og non-profit kunder, spørg venligst for særlige priser.