Invitrogen™ TaqMan™ Genekspression Cells-to-C _T™ Kit

De TaqMan™ Gene Expression Cells-to-C _T™ Kit gør det muligt at udføre ekspressionsanalyse direkte fra dyrkede celler uden RNA-oprensning. Dette sæt sparer tid og tilbyder en enkel arbejdsgang, der er velegnet til nogle få prøver eller let kan inkorporeres i automatiserede applikationer med høj kapacitet.

De TaqMan™ Genekspression Cells-to-C _T Kit er:
• Komplet —optimeret arbejdsgang inkluderer cellelysereagenser med gDNA-fjernelse, RT-enzymblanding, buffer og nye TaqMan™ Genekspression Master Mix
•Hurtig 7-minutters —prøveforberedelse, inklusive DNase-behandling, ved stuetemperatur
•Let lysér prøver i —et rør eller direkte i dyrkningsplader
•Robust genekspressionsanalyse på 10 100.000 —celler pr. prøve; resultater svarende til –dem fra oprenset RNA
•Efficient indeholder tilstrækkelige reagenser til at generere —500 real-time PCR-resultater fra 100 startprøver. Med en unik metode til

lysering af dyrkede celler, samtidig med at genomisk DNA fjernes og RNA-integritet bevares, TaqMan™ Gene Expression Cells-to-C _T Kit indeholder™ revers transcription (RT) reagenser til cDNA-syntese og TaqMan™ Gene Expression Master Mix til real-time PCR-analyse. TaqMan™ primer ⁄probe sæt sælges separat.

Enkel 7-minutters prøveforberedelse: del af en komplet
arbejdsgang Uanset om du bruger plader eller rør, kan de TaqMan™ Gene Expression Cells-to-C _T™ Kit, som bruger den simple 7-minutters prøveforberedelsesprocedure, der er skitseret (se figur), er designet til –10 100.000 dyrkede ⁄celleprøver. Celler vaskes i PBS og lyseres i opløsning i 5 minutter ved stuetemperatur; DNase-behandling kan udføres samtidigt. Lysering afsluttes ved stuetemperatur ved en 2-minutters inkubation med stopopløsning. Lysaterne er nu klar til revers transkription eller opbevaring kl– 20 °C. Fordi prøver kan behandles direkte i kulturbrønde (96 eller 384 brønde), minimeres prøvehåndtering og potentialet for prøvetab eller overførselsfejl, hvilket letter hurtig behandling med høj gennemstrømning. I modsætning til gammeldags RNA-isoleringsprotokoller med flere trin kræves ingen opvarmnings-, vask- eller centrifugeringstrin. Sættet forenkler i høj grad en –besværlig 30 60 minutters proces og reducerer den til 7 minutter.

De TaqMan™ Genekspression Cells-to-C _T™ Kit workflow muliggør uovertruffen genekspressionsevaluering med nogen af> 700.000 TaqMan™ Genekspressionsassays. Dette sæt er blevet grundigt testet for specificitet med et bredt udvalg af TaqMan™ Genekspressionsassays og viser ydeevne svarende til den opnåede med oprenset RNA (se figur).

Opnå uovertruffen ydeevne og følsomhed
I modsætning til nogle konkurrerende kits, der begrænser mængden af lysat i RT-reaktionen til 5 %, TaqMan™ Gene Expression Cells-to-C _T™ Kit kan rumme 45 % af det totale RT-reaktionsvolumen som cellelysat. Derudover kan cDNA omfatte op til 45 % af real-time PCR-reaktionsvolumenet. Det store lysatvolumen i den optimerede RT-reaktion sammen med det store cDNA-volumen i den efterfølgende realtids-PCR ved hjælp af TaqMan™ Gene Expression Master Mix, fører til maksimal følsomhed. Mastermixet forstærker målet præcist og præcist, hvilket muliggør påvisning af små mængder mål, såsom transskriptioner udtrykt ved lave niveauer.

Evnen til at påvise begrænsede målmængder blev testet ved at blande et konstant antal humane celler med forskellige antal museceller. Celleblandingerne blev fremstillet under anvendelse af TaqMan™ Genekspression celler-til- _CT og™ analyseret for et muse-specifikt og human-specifikt gen. Sammenlignende data blev genereret på samme måde med RNA oprenset ved traditionel metodologi. Dataene viser, at RNA fra så få som 10 museceller kunne påvises i en baggrund af RNA fra 10.000 humane celler (se figur). Evnen til TaqMan™ Genekspressionsceller-til-CT _- kit til påvisning™ af relativ lav forekomst af transkripter var ækvivalent med oprenset RNA; på lave niveauer var det overlegent.

Derudover udføres af TaqMan™ Genekspression Cells-to-C _T Kit blev™ sammenlignet med konkurrerende lysat-kits og med oprenset RNA. Input af –100.100.000 ⁄celler lysereaktion blev undersøgt. Følsomheden af TaqMan™ Cells-to- _CT Kit-protokol™ var ækvivalent med den, der blev opnået med oprenset RNA, og den overgik konkurrerende lysater (se figur). Desuden viser manglen på inhibering ved høje cellulære input og den lave variation blandt tekniske replikater pålideligheden af denne tilgang til genekspressionsundersøgelser ved hjælp af dyrkede celler.

Dokumenteret ydeevne, bevist sammen
Alle komponenter i TaqMan™ Gene Expression Cells-to-C _T Kit™ er blevet optimeret til ensartet og pålidelig ydeevne. Dette fjerner gætteriet involveret i at samle separate prøveforberedelse, RT og real-time PCR-kits. Og den TaqMan™ Gene Expression Cells-to-C _T™ Kit er blevet valideret med TaqMan™ Genekspressionsassays for ekstra kvalitetssikring.

Tilbehørsprodukt
The TaqMan™ Cells-to-C _T™ Control Kit blev designet til brug med TaqMan™ Genekspression Cells-to-C _T™ Kit. Dette kit indeholder en endogen kontrol (ACTB) til normalisering af prøvebelastningsvariabilitet og en kunstig XenoRNA™ kontrol og tilsvarende TaqMan™ Genekspressionsanalyse for at overvåge virkningerne af PCR-hæmning.