Invitrogen™ mBESKED mMACHINE™ T7 transkriptionssæt

Sådan fungerer mMESSAGE-kits mMACHINE

mMESSAGE-sæt mMACHINE har et forenklet reaktionsformat, hvor alle fire ribonukleotider og kondensatoranalog blandes i én opløsning. Kapselanalog:GTP-forholdet for denne opløsning er 4:1, hvilket er optimalt for at maksimere både RNA-udbyttet og andelen af afgrænsede transkripter. mMESSAGE-kits mMACHINE er ideelle til rutinemæssig syntese af capped RNA'er til oocytmikroinjektion, in vitro-translation , transfektion og andre anvendelser. De høje udbytter opnås ved at optimere reaktionsbetingelserne for RNA-syntese i nærvær af høje nukleotidkoncentrationer. Derudover er det syntetiserede RNA beskyttet mod nedbrydning af eventuelle forurenende ribonukleaser, der måtte være til stede sammen med RNase-hæmmeren—, en komponent i enzymblandingen.

Brug af mMESSAGE-kits mMACHINE

Ved en 20 μl reaktion under en to timers inkubation vil mMESSAGE mMACHINE højtydende capped RNA-transkription give store mængder capped RNA. Op til 10-50 –gange udbyttet opnået med konventionelle in vitro transkriptionsreaktioner. Forholdet mellem kondensatoranalog og GTP er optimeret for at muliggøre det bedste kompromis mellem udbytte (15 –, 35 μg) og andelen af transkripter, der er caped (80%).

mMESSAGE-sæt indeholder også en LiCl-udfældningsopløsning, som er effektiv til at adskille proteiner og ikke-inkorporerede mMACHINE nukleotider (inklusive fri kapsel-analog) fra det lukkede RNA, hvilket muliggør øget translationseffektivitet. mMESSAGE-sæt mMACHINE er kun optimeret til brug med de polymeraser, der er inkluderet i sættet. Brug af en anden polymerase kan resultere i lave udbytter. mMESSAGE-kits mMACHINE indeholder alle buffere og reagenser, der er nødvendige for 25 transkriptionsreaktioner. Ved at bruge kontrolskabelonen, der følger med kitsene (Xenopus elongation factor 1α, pTRI Xef), vil hver mMESSAGE-reaktion mMACHINE give cirka 20-30 – μg RNA ved brug T3 af T7 RNA-polymerase eller cirka 15 –25 μg RNA ved brug af SP6 RNA-polymerase.