Invitrogen™ LeukoLOCK™ Total RNA isolationssystem

De LeukoLOCK™ Total RNA Isolation System er en innovativ metode til cellulær fraktionering af fuldblod og total RNA stabilisering og ekstraktion fra leukocytpopulationen. Sættet består af en LeukoLOCK Fraktionering& Stabiliseringssæt (fås også separat; Kat. nr. AM1933) og en LeukoLOCK Total RNA Isolation Kit.

De LeukoLOCK systemet er optimeret til brug med menneskeblod. Blod er et lager af cellulær information; tilstedeværelsen af globin-mRNA i RNA fremstillet ud fra fuldblod kan imidlertid interferere med nedstrøms ekspressionsprofileringsapplikationer. De LeukoLOCK Systemet anvender filterbaseret leukocyt-udtømningsteknologi til at isolere leukocytter fra fuldblod og senere™ RNA-opløsning for at stabilisere cellerne på filteret. Ved at udelukke røde blodlegemer er RNA'et, der er oprenset fra indfangede leukocytter, i sagens natur udtømt for globin-mRNA, hvilket forbedrer prøveanvendeligheden til ekspressionsprofilering og andre applikationer.

Leukocytfangst og stabilisering
–En 9 10 ml prøve af antikoaguleret blod ledes gennem en LeukoLOCK filter, som fanger den samlede leukocytpopulation, mens røde blodlegemer (inklusive retikulocytter), blodplader og plasma elimineres. Efter skylning med fosfatpufret saltvand skylles filteret med RNA senere opløsning for at stabilisere RNA'et i de opfangede leukocytter. RNA'et kan isoleres med det samme, eller stabiliserede celler kan holdes i flere dage ved stuetemperatur eller i længere perioder kl.– °20 C eller– °80 C.

RNA-isolering
Oprensning af RNA'et udføres ved først at forstyrre de indfangede celler i en guanidiniumthiocyanatbaseret –opløsning, der frigiver RNA'et og samtidig inaktiverer nukleaser. Cellelysatet opsamles og behandles kort med Proteinase K. RNA renses derefter fra lysatet ved hjælp af MagMAX magnetisk perle-baseret teknologi til vask, efterfulgt af DNase-behandling (med TURBO DNase™ ) og endelig oprydning.

Ekspressionsundersøgelser
Både kvantitative RT-PCR- og mikroarray-ekspressionsundersøgelser har valideret egnetheden af det oprensede RNA til pålidelig transkriptomprofilering. Sammenlignet med RNA behandlet med en almindeligt anvendt blod-RNA-isoleringsprocedure, RNA isoleret med LeukoLOCK systemet producerer længere median-aRNA efter amplifikation og højere procent tilstedeværende kald uden at kræve yderligere post-ekstraktionstrin for at fjerne globin-mRNA. Da globin-aRNA repræsenterer –25-40% af aRNA-toppen fra total-RNA i fuldblod, er udbyttet af total-RNA forståeligt nok lavere med metoder, der udtømmer uønskede globin-transkripter. RNA amplificeret efter LeukoLOCK oprensning giver større array-følsomhed på grund af den dramatiske reduktion i konkurrerende globin-transskriptioner.

Kit giver
Gendannelsen varierer fra donor til donor, men er –typisk 10 20μ g RNA pr. –9 10mL fuldblod. RNA udvundet ved hjælp af LeukoLOCK Systemet indeholder mindre end en tiendedel af mængden af reticulocyt-afledte alfa- og beta-globin-mRNA'er, der er til stede i typiske RNA-prøver fra ufraktioneret fuldblod.

• Fraktionerer leukocytter fra fuldblod på få minutter
• Ekstraherer totalt RNA fra leukocytter
• Der kræves ingen yderligere globinreduktionstrin
• Stabiliserer RNA for at bevare ekspressionsprofilen
• Bevarer leukocytter ved stuetemperatur i dagevis

Ikke high-throughput kompatibel (manuel)