Thermo Scientific™ ActivX™ Desthiobiotin-FP Serine Hydrolase Probe

ActivX™ FP-prober har en reaktiv fluorphosphonatgruppe, der specifikt og kovalent mærker serinet på det aktive sted i enzymatisk aktive serinhydrolaser. Disse prober er tilgængelige med et desthiobiotin-mærke (biotinanalog) til selektiv berigelse eller en reaktiv azido-gruppe (Staudinger-reagenser), der letter multipleksmærkning, når de bruges sammen med phosphin- eller alkynderivatiserede mærker.

ActivX aktiv-site berigelsesprober er fordelagtige til bestemmelse af aktive enzymniveauer ved anvendelse af analog-mærkede prober for at tillade profilering af både inaktive og aktive enzymer. De ActivX prober beriger kun selektivt de enzymer, der er funktionelt aktive og biologisk relevante på mærkningstidspunktet. Med selektiv berigelse kan man identificere og profilere målenzymklasser på tværs af prøver eller kan vurdere specificiteten og affiniteten af enzyminhibitorer.

Ansøgninger af ActivX FP-sonder:
• Bestem serinhydrolaseenzymaktivitet i celler og lysater
• Kortlægning af det aktive sted af serin af funktionelt forskellige medlemmer af serinhydrolasefamilien (f.eks. proteaser, lipaser, esteraser)
• Screen for bindingsaffiniteter for små molekyler og inhibering af det aktive sted
• Profil serinhydrolaser ved hjælp af fluorescerende, Western blot eller massespektrometri

-arbejdsgange. Serinhydrolase-superfamilien er en af de største, mest forskelligartede enzymfamilier i eukaryote proteomer. Serinhydrolaser er generelt grupperet i to store familier: serinproteaser (f.eks. trypsin, elastase og thrombin) og metaboliske serinhydrolaser. Metaboliske serinhydrolaser er opdelt i flere enzymunderklasser (f.eks. esteraser, lipaser, amidaser og peptidaser) baseret på struktur, katalytisk mekanisme og substratpræference. Disse prober kan bruges til at vurdere aktivitet eller screene små molekylehæmmere mod enzymer afledt af cellelysater, subcellulære fraktioner, væv og rekombinante proteiner.

Vurdering af aktiv-sted-mærkning med desthiobioin-prober kan udføres ved enten Western blot eller massespektrometri (MS). Til Western blot-arbejdsgangen beriges desthiobiotin-mærkede proteiner til SDS-PAGE-analyse og efterfølgende påvisning med specifikke antistoffer. Til MS-arbejdsgangen reduceres desthiobiotin-mærkede proteiner, alkyleres og fordøjes enzymatisk til peptider. Kun de desthiobiotin-mærkede peptider med aktivt sted beriges til analyse med LC-MS/MS. Begge arbejdsgange kan bruges til at bestemme inhibitor-målbinding, men kun MS-arbejdsgangen kan identificere globale inhibitor-mål og off-targets. Azido-FP-proben kan anvendes i kombination med et phosphin- eller alkyn-derivatiseret tag til enten påvisning eller berigelse af serinhydrolaser ved hjælp af Western blot eller massespektrometri.

Disse produkter er underlagt en etiketlicens med begrænset brug.